Validação funcional dos sítios de fosforilação regulados pela via de resposta ao dano no DNA em condição de estresse de replicação

Abstract

A via de resposta ao dano de DNA (RDD) é importante no monitoramento de estruturas aberrantes de DNA. Em células humanas, a via de RDD é regulada pelas quinases ATM, ATR, Chk1 e Chk2. Em Saccharomyces cerevisiae, essas quinases correspondem respectivamente a Tel1, Mec1 e Rad53. Utilizando uma abordagem fosfoproteômica quantitativa, identificamos 180 proteínas contendo 235 resíduos fosforilados in vivo pelas quinases Mec1, Tel1 e/ou Rad53. Entretanto, a relevância biológica de grande parte dessas fosforilações permanece desconhecida. Para avaliar a relevância dos sítios de fosforilação, mutantes nocaute para as 180 proteínas identificadas como alvo de Mec1/ Tel1 e/ou Rad53 foram submetidos a um ensaio de sensibilidade utilizando drogas que induzem o estresse de replicação, revelando a presença de 62 mutantes com sensibilidade a uma ou mais drogas. Em uma segunda etapa, os mutantes que apresentaram sensibilidade foram testados individualmente para validação dos resultados obtidos na primeira etapa. Dentre 180 proteínas não essenciais fosforiladas in vivo pelas quinases Mec1, Tel1 ou Rad53, pelo menos 48 delas foram categorizadas como relevantes para a tolerância da célula ao estresse de replicação. Dentre esses 48 mutantes, vps72Δ apresentou uma alta sensibilidade ao tratamento com metanossulfonato de metila. A proteína Vps72 apresenta uma fosforilação dependente de Tel1/Mec1 na serina 425 além de outros 8 potenciais sítios de fosforilação nas posições T94, S102, T237, S479, T579, T627, T694 e S784. Utilizando uma técnica para indução de mutação sítio dirigida, os 9 sítios de fosforilação foram mutados gerando o fosfomutante vps72-9A, entretanto, esse fosfomutante não foi capaz de recapitular a sensibilidade observada no mutante nocaute vps72Δ. Esse resultado sugere que a função de Vps72 na tolerância ao estresse de replicação não depende da fosforilação dos sítios T94, S102, T237, S425, S479, T579, T627, T694 e S784.